一、 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
表格一:實(shí)驗(yàn)儀器
儀器 | 廠(chǎng)家 | 型號(hào) |
細(xì)胞培養(yǎng)箱 | Thermo Scientific | HERA cell CO2 |
低溫高速離心機(jī) | 64R | BECKMAN |
流式細(xì)胞儀 | BD | FACS Calibur |
表格二:試劑
試劑 | 廠(chǎng)家 |
DMEM 培養(yǎng)液 | Hyclone |
PI | Sigma |
PBS 7.4 (0.1 M) | 自配 |
乙醇 | 國(guó)藥集團(tuán) |
RNA 酶 | Sigma |
二、 實(shí)驗(yàn)步驟
細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A172 細(xì)胞,按 1*105個(gè)/mL 以 1mL 體積接種于 6 孔板內(nèi)。無(wú)抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜,到轉(zhuǎn)染時(shí)使細(xì)胞達(dá)到 70%的匯合率。
轉(zhuǎn)染
將 12.5uL siRNA 溶于 387.5uL 無(wú)血清的 DMEM 中,混合均勻。
將 12.5uL Lipofectamine 2000 溶于 387.5uL 無(wú)血清的 DMEM 中,混合均
勻。在室溫下孵育 5 分鐘。
將上述兩種混合物混合(總體積 800uL),輕輕混合均勻在室溫下孵育
20 分鐘形成復(fù)合物。
在 6 孔板中每孔加入 800uL 復(fù)合物。十字法混合均勻。
細(xì)胞在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6h 后棄上清液,并加入 10%胎牛血
清的 DMEM 培養(yǎng)液。
固定
培養(yǎng) 48h 后小心吸去上清,胰酶消化并離心收集細(xì)胞(1000rpm/min),棄上清,用預(yù)冷 PBS 洗細(xì)胞 2 次,加入預(yù)冷 70%乙醇, -20℃固定保存。
染色
離心,棄上清;
1mL PBS 洗 1 次,離心;
加入 10uL RNase A(20ug/mL)于 500uL PBS, 37 度 30min 孵育后,離心;
PBS 洗 1 次,離心;
加 10uL PI (50 ug/mL)于 500 uL PBS,室溫避光 30min。
檢測(cè)
以標(biāo)準(zhǔn)程序用流式細(xì)胞儀檢測(cè),汞激發(fā)波長(zhǎng) 488nm,計(jì)數(shù) 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,結(jié)果
使用 Modfit 軟件分析。
三、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
省略
15021202164
上海市楊浦區(qū)國(guó)康路100號(hào)2層
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